Imagerie longitudinale à deux photons de neurones marqués par fluorescence dans l’hippocampe d’une souris vivante

Résumé

Source : Ulivi, A. F., et. al. Imagerie longitudinale à deux photons de l’hippocampe dorsal CA1 chez des souris vivantes. J. Vis. exp. (2019)
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p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Cette vidéo fait la démonstration de l’imagerie longitudinale à deux photons de neurones pyramidaux marqués par fluorescence chez une souris vivante, montrant la préparation, l’alignement des canules et l’imagerie des dendrites et des épines dendritiques pour étudier la structure neuronale dans la région CA1 de l’hippocampe.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la séance d’imagerie
2. Allumez la configuration d’imagerie à l’avance et laissez le laser se réchauffer et se stabiliser, si nécessaire.
3. Anesthésie la souris. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie à 3 % d’isoflurane dans 1 L/min O₂ et attendez qu’elle perde conscience. Évaluez l’anesthésie à l’aide du test du réflexe de pincement des orteils.
4. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement le film adhésif de la plaque du support de tête. Tenez la souris dans une main et la plaque de support de tête avec les doigts. Retirez le film délicatement, pour éviter d’endommager la préparation.
5. Placez la souris sous le microscope, au-dessus du tapis chauffant et fixez la plaque de tête au support (Figure 1D).
6. Positionnez le cône nasal de manière à couvrir le museau et diminuez l’isoflurane à 1,5-2 %.
7. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
8. Nettoyez la canule d’imagerie en la rinçant à l’eau déminéralisée. Utilisez une seringue et une aiguille fine pour déposer de l’eau dans la canule et une pompe à vide pour l’enlever.

2. Séance d’imagerie

1. Utilisez des objectifs à faible grossissement et à longue distance de travail pour vérifier visuellement la canule pour détecter l’eau résiduelle, la saleté, l’intégrité et la présence de fluorescence.
2. Alignez la canule sur l’axe optique en ajustant les angles des bras du porte-tête.
3. Passez aux objectifs à immersion dans l’eau 25X 1,0 NA (ouverture numérique), WD 4 mm (distance de travail) ou 40X 0,8 NA, WD 3 mm. Ajoutez suffisamment d’eau déminéralisée pour remplir la canule et maintenez l’excès d’eau sur le dessus de la canule. Évitez la formation de bulles d’air.
4. Utilisez l’excitation à deux photons (2P) et des signaux fluorescents d’image.
   REMARQUE : Le protocole d’imagerie dépend fortement des échelles de temps et spatiales à imager. Veuillez vous référer aux résultats représentatifs de la section et à la discussion pour plus de détails sur les paramètres d’imagerie que nous avons utilisés pour produire les images présentées dans cet article.

Résultats

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube en acier inoxydable Ø 3,0 x 0,25 mm (Ø intérieur 2,5 mm ) L = 500 mm	Sawade	R00303	Tube en acier inoxydable pour l’anneau métallique de la canule
Verre de couverture de microscope (rond de 4 mm)	Engelbrecht Medizin et Labortechnik	<
Isofluran CP, Flasche 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	Liquid isoflurane pour l’anesthésie
Vaporisateur de remplissage d’entonnoir d’isoflurane de l’appareil de Harvard	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Vaporisateur Isoflurane
Lab Active Scavenger	Gropper Medizintechnik	UV17014	Isoflurane scavenger system
CMA 450 Temperature Controller	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	Couverture chauffante
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG		Pommade ophtalmique
Head plates	Custom made
Pince de tête	Custom made		Porte-plaque de tête
Supports de poteaux de piédestal	Thorlabs	PH20E/m	support de plaque de tête
Poteau en acier inoxydable	Thorlabs	TR30/m	support de plaque de tête
Poteau en acier inoxydable	Thorlabs	TR75/m	support de plaque de tête
Poteau en acier inoxydable	Thorlabs	TR150/m	support de plaque de tête
pinces de connecteur de poteau	Custom made		Support de plaque de tête
Planche à pain en aluminium, 300 mm x 450 mm x 12,7 mm, M6 Taps	Thorlabs	MB3045/m	Stade de microscope
7 » x 4 » Lab Jack	Thorlabs	L490/m	Stade de microscope
Masque facial discret petites souris	Emka Technologies	VetFlo-0801	Porte-masque d’anesthésie
capteur de puissance modèle 1918-R	Newport		Capteur de puissance
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		Lampe à fluorescence
Microscope à deux photons	Bruker	Ultima IV	Microscopes à deux photons
Microscope à deux photons	Thorlabs	Bergame	Microscopes à deux photons
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		Objectives
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Objectives
Laser accordable Ultafast pour l’excitation 2P	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	Excitaiton lasers
Laser accordable Ultafast pour l’excitation 2P	Spectraphysics	InSight DS+ Dual beam	Excitaiton lasers
Laser accordable Ultafast pour l’excitation 3P	Cohérent	Monaco	Excitaiton Lasers

td style='background-color :#ffffff ;color :#1a202c ;font-family :Roboto ;font-size :7pt ;font-weight :normal ;overflow :hidden ;padding :0px 3px ;vertical-align :bottom ;white-space :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>Couvre-lames en verre pour la canule en verre< td style='Couleur-de-fond :#ffffff ;couleur :#1a202c ;famille-de-police :Roboto ;taille-de-police :7pt ;poids-police :normal ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :bas ;espace-blanc :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>taille de 30 mm x 10 mm ; trou de 8 mm de diamètre, titane